食品分离技术论文

导读:从动物细胞中提取、分离纯化蛋白质,摘要:详细介绍了动物蛋白质的常见提取、分离纯化方法,叙述了分离纯化方法的原理和主要步骤,评价分离方法的可行性,关键词:蛋白质提取分离纯化水溶液提取法有机溶剂提取法超滤分离技术双水相萃取技术,高效的纯化技术和手段是研究动物蛋白质的重要基础和关键之一,对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎,二、蛋白质的分离纯化,但在同一条件下,不同的蛋白质因

食品分离技术论文

从动物细胞中提取、分离纯化蛋白质

摘要:详细介绍了动物蛋白质的常见提取、分离纯化方法,各种方法的优点,叙述了分离纯化方法的原理和主要步骤,评价分离方法的可行性,并列举了影响提取有效成分的因子。

关键词:蛋白质 提取 分离纯化 水溶液提取法 有机溶剂提取法 超滤分离技术 双水相萃取技术

蛋白质是生物有机体的重要组成成分,是生命的物质基础之一。随着分子生物学、结构生物学、基因组学等研究的深入和对蛋白质功能、生物活性认识的提高,许多学者将生命科学领域的研究焦点从基因转向蛋白质。研究动物蛋白质的结构和功能,首先要得到高纯度的具有生物活性的目的蛋白,高效的纯化技术和手段是研究动物蛋白质的重要基础和关键之一。

1.材料的选择与预处理

材料选定通常要进行处理。要剔除结缔组织及脂肪组织。如不能立即进行实验,则应冷冻保存。除了提取及胞细外成分,对细胞内及多细胞生物组织中的蛋白质的分离提取均须先将细胞破碎,使其充分释放到溶液中。不同生物体或同一生物体不同的组织,其细胞破坏难易不一,使用方法也不完全相同。如动物胰、肝、脑组织一般较柔软,作普通匀浆器磨研即可,肌肉及心组织较韧,需预先绞碎再制成匀桨。

2.动物组织的细胞破碎

主要通过机械切力的作用使组织细胞破坏。常用器械有:①高速组织捣碎机(转速可达10000rpm,具高速转动的锋利的刀片),宜用于动物内脏组织的破碎;②玻璃匀浆器(用两个磨砂面相互摩擦,将细胞磨碎),适用于少量材料,也可用不锈钢或硬质塑料等,两面间隔只有十分之几毫米,对细胞破碎程度较高速捣碎机高,机械切力对分子破坏较小。小量的也可用乳钵与适当的缓冲剂磨碎提取,也可加氧化铝、石英砂及玻璃粉磨细。但在磨细时局部往往生热导致变性或pH 显著变化,尤其用玻璃粉和氧化铝时。磨细剂的吸附也可导致损失[1]。 一、蛋白质的提取

大部分动物组织蛋白质可溶于水、稀盐、稀酸或稀碱溶液中,少数与脂类结合的蛋白质溶于乙醇、丙酮及丁醇等有机溶剂。

(一)水溶液提取法

提取动物组织蛋白质一般采用各种水溶液。稀盐和缓冲体系的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大,是最常用的溶剂。稀盐溶液(一般用NaCl 溶液)可促进动物蛋白质溶解,同时因盐离子与蛋白质部分结合,具有保护蛋白质不易变性的优点[2]。

(二)有机溶剂提取法

有机溶剂提取用于提取蛋白质的实例至今是不多的。但一些和脂结合较牢或分子中非极性侧链较多的蛋白质,不溶于水、稀盐或稀碱液中,可用不同比例的有机溶剂提取。从一些粒线体(Mitochondria)及微粒体(Microsome)等含多量脂质物质中提取蛋白质时,采用Morton 的丁醇法效果较好。因丁醇使蛋白质的变性较少,亲脂性强,易透入细胞内部,与水也能溶解10%,因此具有脂质与水之间的表面活性作用,可占据蛋白质与脂质的结合点,也阻碍蛋白质与脂质的再结合,使蛋白质在水中溶解能力大大增加。丁醇提取法的pH 及温度选择范围较广(pH3~10,温度-2℃至40℃)。国内用该法曾成功地提取了琥珀酸脱氢酶。丁醇法对提取碱性磷酸脂酶效果也是十分显著的。胰岛素既能溶于稀酸、稀碱又能溶于酸性乙醇或酸性丙酮中。以60—70%的酸性乙醇提取效果最好,一方面可抑制蛋白质水解酶对胰岛素的破坏,同时也达到大量除去杂蛋白的目的。

提取的好坏受到多种因素的影响包括:

1)溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH值、温度、表面活性剂、变性剂(如尿素和盐酸胍)和粘稠度、溶液的更换;

2)材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理; 3)目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量; 4)其它因素 搅拌、提取时间的长短[2]。 二、蛋白质的分离纯化

影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。

根据分子大小分离纯化:

一、超滤分离技术

蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果[2]。

在离心力或较高压力下,选择适当孔径的半透膜(膜孔径1~20 nm),截留所需的大分子蛋白质,从而实现分离。刘爱国等[8]选取硫酸铵盐析法、超滤法及盐析- 超滤结合法,从牛血清中得到免疫球蛋白粗提物。结果显示以盐析-超滤结合法分离效果最佳。

原理:超滤技术是通过膜表面的微孔结构对物质进行选择性分离。当液体混合物在一定压力下流经膜表面时,小分子溶质透过膜(称为超滤液),而大分子物质则被截留,使原液中大分子浓度逐渐提高(称为浓缩液),从而实现大、小分子的分离、浓缩、净化的目的。

超滤膜分离技术作为现代分离技术,因其具有设备简单、能在低温下操作、能耗小、生物活性物质不易失活、效率高等特点,近年来被广泛应用于生物活性物质的分离、浓缩和纯化[5]。

影响超滤效果的因素有料液流速,操作压力,温度,运行周期,料液的预处理,进料浓度,膜的清洗等[2]。

二、双相水萃取技术

萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产

品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中[6]。

主要步骤:

1、选择双水相系统的溶质:根据欲分离蛋白质和杂质的溶解特性,选择双水相系统的溶质。常用水溶性高分子聚合物和各种盐类,且通常采用两种高分子化合物系统。

2、制备双水相系统:此为关键步骤。双水相系统的制备,一般是将两种分别配制成一定浓度的水溶液,然后将两种溶液按照不同的比例混合,静止一段时间,当两种溶质的浓度超过某一浓度范围时,就会产生两相。

3、萃取分离:双水相系统+欲分离蛋白质混合物→充分搅拌,混合均匀→静止→混合物中不同组分按其分配系数不同分配在两相中,并达平衡→通过离心机或其他方法将两相分开收集→达到分离目的→蛋白质 [2]。

原理:双水相体系是指某些高聚物之间或高聚物与无机盐之间,在水中以适当的浓度溶解后形成的互不相溶的两相或多相水相体系。高聚物- 高聚物- 水体系主要依靠高聚物之间的不容性,即高聚物分子的空间阻碍作用,促使其分相;高聚物- 盐- 水体系一般认为是盐析作用的结果。

双水相萃取与水- 有机相萃取的原理相似,都是依据物质在两相间的选择性分配,不同之处在于萃取体系的性质差异。当生物物质进入双水相体系后,由于表面性质、电荷作用和各种力(如憎水键、氢键和离子键等) 的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不同。分配系数K 等于两相中生物物质的浓度比,由于蛋白质的K 值不相同(大致在011~10 之间) ,因而双水相体系对各类蛋白质的分配具有较好的选择性[7]。

双水相萃取技术的分离效果由分配系数来表征,而影响待分离物质在双水相体系中分配行为的主要参数有成相聚合物的种类、成相聚合物的分子质量和总浓度、无机盐的种类和浓度、pH 值、温度等[2]。

双水相体系萃取具有如下特点:

(1)含水量高(70%~90%),是在接近生理环境的温度和体系中进行萃取,不会引起生物活性物质失活或变性;

(2)分相时间短,自然分相时间一般为5~15min;

(3)界面张力小(10-7~10-4mN/m),有助于强化相际间的质量传递; (4)不存在有机溶剂残留问题;

(5)大量杂质能与所有固体物质一同除去,使分离过程更经济; (6)易于工程放大和连续操作[2]。

由于双水相萃取具有上述优点,因此,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。

动物蛋白质在组织或细胞中一般以复杂的混合物形式存在,每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质,其提取和纯化是一项艰巨而复杂的任务。要从复杂的混合物中完全提取出某种动物蛋白质,尚无普遍适用的方法。但任何一种动物蛋白质都可以根据其物理、化学性质及生物学特性,通过实验摸索,选择一套合适的提纯程序获取高纯度的蛋白质。动物蛋白质分离纯化技术的不断深入研究,将为蛋白质资源及动物药的开发利用提供更为广阔的发展空间。 参考文献:

[1] 李宏君,尹际彤,杨启东. 细胞破碎方法简述[J]. 黑龙江医药,2002,15(2):124.

[2] 高孔荣,黄惠华,梁照等.食品分离技术.华南理工大学出版社,1998.11 [3] 李杨,韩梅.亲和层析技术在生物学中的应用及发展[J].生命科学研究,2006,10(1):12-16.

[4] Robb V A, Li W, Gutmann D H. Disruption of 14-3-3 bindingdoes not impair Protein 4.1 B growth suppression[J]. Ontogeny, 2004, 23(20): 3589-3596.[J].2006,23(3):149-151.

[5] 王学松.膜分离技术及其应用.北京:科学出版社,1994

[6] 蒋梅,杨仕标,王秀琼,等.蛋白质提纯的研究进展[J].黑龙江畜牧兽医,2008,(3):25-26.

[7] 徐光宪等.萃取化学原理.上海:上海科学出版社,1984

[8] 刘爱国,杨桂有,刘晓磊,等. 牛血清中免疫球蛋白的提取研究[ J ] . 食品科学,2007,28(9):261-265.

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