中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法

导读:中国药品检验标准操作规程2010版微生物限度检查法,6.6.1革兰染色(见大肠埃希菌检查法6.5),3h后开始检查,检查时,做控制菌检查,在微生物菌种鉴定中目前应用较多的2003年出版的第八版《美国临床微生物手册》共收,弱或无无中国药品检验标准操作规程2010版微生物限度检查法,8.5目前商品化的金黄色葡萄球菌检测试剂多家微生物相关制剂公司有售,对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品,检查梭菌的方

中国药品检验标准操作规程2010版  微生物限度检查法

中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法

6.3 增菌培养

取营养肉汤(或亚碲酸钠肉汤)培养基3份,每份100ml,1份加入10ml供试液,1份加入供试液及阳性对照菌,1份加入与供试液等量的0.9%无菌氯化钠溶液或磷酸盐缓冲液(pH7.2)作为阴性对照,置30~35℃培养18~24h(必要时可延至48h)。阴性对照应无菌生长。

6.4 分离培养将上述供试品增菌培养液,以接种环沾取1~2环培养液,划线接种于卵黄氯化钠琼脂平板或甘露醇氯化钠琼脂平板上,置30~35℃培养24~72h。当供试品分离平板无菌落生长,或有菌落生长但不同于下表所列特征,可报告为1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。

表5 金黄色葡萄球菌在三种选择性培养基上菌落形态特征

培养基 卵黄氯化纳琼脂 甘露醇氯化纳琼脂

菌落形态特征

金黄色,圆形凸起,边缘整齐,光滑湿润,外周有分解卵磷脂后产生的乳浊圈,菌落直径1~2mm

金黄色,圆形凸起,边缘整齐.光滑湿润.外周有黄色环。菌落直径0.7~1mm

6.5 纯培养

当供试品分离平板生长菌落与表1所列菌落特征相似或疑似时,应选取2~3个以上菌落,分别用接种针,轻轻沾取菌落中心表面培养物,接种于营养琼脂斜面上,于30~35℃培养18~24h,取营养琼脂斜面培养物作革兰染色、镜检及接种营养琼脂肉汤于30~35℃培养18~24h做血浆凝固酶试验。

6.6 革兰染色、镜检

6.6.1 革兰染色(见大肠埃希菌检查法6.5)

6.6.2 镜检金黄色葡萄球菌为革兰阳性球菌,无芽孢,一般不产生荚膜。排列呈不规则的葡萄状,亦可呈单个、成双或短链状排列。

6.7 血浆凝固酶试验

试管法:取无菌试管(10mm×100mm)3支,各加入血浆和0.9%无菌氯化钠溶液(1:1)0.5ml,1支加入琼脂斜面培养物菌悬液(或被检菌的营养肉汤培养液)0.5ml,其余2支作对照管:1支加入金黄色葡萄球菌 [CMCC(B) 26003] 培养物菌悬液或营养肉汤培养液0.5ml作为阳性对照;另一支加入营养肉汤或0.9%无菌氯化钠溶液0.5ml作阴性对照。三管同时置37℃水浴或恒温培养箱,3h后开始检查,以后每隔适当时间观察一次,直至24h。检查时,轻轻将试管倾斜(动作勿大),仔细观察,阴性对照管血浆流动自如,阳性对照管血浆呈凝固状,试验管呈凝固者为阳性反应;不凝固为阴性反应。阳性对照管和阴性对照管任何一管不符合要求时,应另制备血浆,重新试验。

7 结果判断

如果革兰染色结果清晰可靠(必要时加做已知革兰染色结果的细菌进行染色质量控制),凝固酶试验阴性对照试验呈阴性,阳性对照试验呈阳性结果,供试品培养物按下列情况报告或处理:

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7.1 疑似菌革兰染色呈阳性球菌,血浆凝固酶试验阳性反应者,报告1g或1ml供试品检出金黄色葡萄球菌(少许菌株可能不是金黄色葡萄球菌而是葡萄球菌属的其他菌种)。

7.2 革兰染色镜检不是革兰阳性球菌,或血浆凝固酶试验阴性反应,报告1g或1ml供试品未检出金黄色葡萄球菌。

7.3 阴性对照有菌生长,试验结果无效。

7.4 阳性对照试验呈阴性结果,应当加做验证试验,考察检品是否有抑菌活性。 8 注意事项

8.1 金黄色葡萄球菌在上述两种分离培养基上的典型菌落为金黄色。但由于受药物影响或非典型菌株存在,亦可呈橙黄色、柠檬色或白色。做控制菌检查,对非典型菌落也有必要进行凝固酶试验做金黄色葡萄球菌的筛查,以防漏检金黄色葡萄球菌。培养基存放时间和培养时间影响色素产生,故培养基应新鲜配制。培养时间宜48h以上。

8.2 如果使用干燥培养基,应按说明书配制,注意pH值是否符合规定,必要时应校正pH后灭菌使用。

8.3 血浆凝固酶试验应用新鲜培养物及新鲜血浆。如用陈旧培养物及血浆(纤维蛋白常已析出)易导致假阴性反应。此外,观察结果时不要摇动试管,因凝固初期凝块易破坏,引起假阴性试验。

8.4 葡萄球菌属在新版《Bergey手册》中共收载为28种,在微生物菌种鉴定中目前应用较多的2003年出版的第八版《美国临床微生物手册》共收录35个菌种,44个菌型。常见有金黄色葡萄球菌与表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌3种。可参照下表进行鉴定。其中又以金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的鉴别最为重要。

表6 3种葡萄球菌的主要性状

性状 菌落色素 大小(菌落直径) α溶血毒素 甘露醇 需氧 厌氧 凝固酶 卵黄反应 耐热DNA酶 对新生霉素敏感性 噬菌体分型 A蛋白 致病性 金黄色葡萄球菌 主要为金黄色 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌 0.8~1.0mm + + + + + + S 主要为白色 0.5~1.5mm -/极少+ d - - - - S 主要为柠檬色 0.5~1.5mm - d - - - - R 多数能分型 + 不能分型 - 不能分型 - 强 第34页,共47页

弱或无 无 中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法

d结果不确定,S敏感,R耐药

8.5 目前商品化的金黄色葡萄球菌检测试剂多家微生物相关制剂公司有售,试剂具有较好的稳定性、准确性。商品化的检测试剂应当在适当的条件下保存,在有效期内应用。

(六)梭菌

1 简述

梭菌属(Clostridium)过去称为梭状芽孢杆菌属,菌体1um×5um左右的革兰阳性杆菌,能形成芽孢。芽孢多大于菌体的宽度,细菌膨胀呈梭形,故名梭状芽孢杆菌。该菌属中主要病原菌有产气荚膜梭菌(C.perfringens)、破伤风梭菌(C.tetani)、肉毒梭菌(C.botulinum)和艰难梭菌(C.difficile),均能产生强烈的外毒素使人和动物致病。因此,对于某些用于阴道、创伤、溃疡的药品,必须控制梭菌。

检查梭菌的方法主要是增菌产毒培养和镜检形态观察,必要时做分离培养后再行鉴定。 2 仪器、设备及用具 2.1 玻璃器皿

试管(30mm×200mm)等。洗涤干净,无残留抗菌物质,包扎后,灭菌备用 [见细菌、霉菌(酵母菌)计数]。

2.2 天平、离心机、显微镜、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱 [见细菌、霉菌(酵母菌)计数]。 2.2.1 天平、高压蒸汽灭菌器、恒温干燥箱等应定期进行校验。 2.2.2 厌氧培养袋、箱(罐)等(有商品供应),经测试后选用。 2.3 洁净实验室或净化工作台 [见细菌、霉菌(酵母菌)计数2.1.1]。 2.4 手术镊、手术剪及取样匙,应严密包扎,灭菌备用。 3 试液

3.1 革兰染色液(附件二2.10,2.16,2.4) 3.2 厌氧指示剂(附件二4.8) 3.3 3%过氧化氢溶液 3.4 75%乙醇溶液 3.5 碘酊溶液或碘伏

3.6 0.9%无菌氯化钠溶液(附件二3.1) 3.7 苯扎溴铵(1:1000)溶液 4 培养基

4.1 硫乙醇酸盐流体培养基(附件二5.33)

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4.2 梭菌增菌培养基(附件二5.29)

4.3 哥伦比亚琼脂培养基(含庆大霉素20mg/L和不含庆大霉素)(附件二5.30) 5 对照用菌液

生孢梭菌(Clostridium sporogenes)[CMCC(B) 64941]。

菌液制备 取生孢梭菌接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中,置30~35℃培养18~24h,用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含10~100cfu的菌液。生孢梭菌标准菌液计数可取每毫升含100~1000cfu的菌液0.1ml涂布于哥伦比亚琼脂培养基平板置厌氧条件下培养48~72h计数;也可以取每毫升含10~100cfu的菌液1ml接种于不少于12ml硫乙醇酸盐流体培养基中,摇匀,置30~35℃培养18~20h计数其中的灯笼状菌团,一般情况下该灯笼状菌团数与平板计数菌落数相当。[见方法验证2.4]

生孢梭菌菌种的保存可取其硫乙醇酸盐流体培养物混匀、冻存管分装、超低温保存(如-80℃),用时取出自然解冻、经硫乙醇酸盐流体培养基复苏、复壮,制备新鲜培养物使用。

6 操作方法

6.1 不同剂型样品的前处理

6.1.1 散剂除去包装,直接称取规定量的样品即可。 6.1.2 胶囊除去包装,连壳一起称取规定量样品。

6.1.3 软膏剂及栓剂称取样品10g,按细菌、霉菌、(酵母菌)计数6.23规定的适宜方法乳化,乳化后加入预热至45℃的0.9%无菌氯化钠溶液,制成1:20供试液。

6.2 增菌培养

6.2.1 厌氧培养装置的准备除商品厌氧培养袋、箱、罐按使用说明要求准备外,实验室亦可用真空干燥器、标本瓶或其他适宜容器替代使用,可选用下列一种方法制备厌氧条件:

6.2.1.1 冷触媒法 临用前,取试管或其他适宜容器3支,1支称入硼氢化钠0.22g(以厌氧培养容器容积1L计),1支称取枸橼酸0.33g、碳酸氢钠0.37g,另1支放入经活化的钯粒约1g,与接种后的供试品培养管(或平板)及厌氧指示剂管1支,同时置于厌氧培养容器内,随即各加水5ml于前2支管(或容器)中,迅速密封容器盖。钯粒为覆盖钯的氧化铝的球状或条状颗粒(有商品出售),用前需经160℃干烤2h,或在电炉上灼烧5min使其活化。由于每用1次便失去催化性,因此,再次使用时需按上法活化后方能使用。将钯粒若干置室温水中,附有大量气泡者为活性良好,可直接使用。此法可作为钯粒的活性检查。

6.2.1.2 焦性没食子酸法用前,取培养皿或其他适宜容器1支,加入焦性没食子酸10g及无水碳酸钠5g(以厌氧容器容积1L计),与接种后的供试品培养管(或平板)及厌氧指示剂管1支同时置于厌氧容器内,迅速密封容器盖。

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6.2.2 增菌培养 取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml)4份,其中2份置80℃保温10min后迅速冷却。上述4份供试液直接或处理后分别接种至100ml的梭菌增菌培养基中,其中2份(直接1份,处理后1份)梭菌增菌培养管中分别加入阳性对照菌(10~100cfu)。置厌氧条件下培养48h。

6.3 分离培养取上述每一培养物0.2ml,分别涂抹接种于含庆大霉素的哥伦比亚琼脂培养基平板上,置厌氧条件下培养48~72h。若供试品平板上无菌落生长,判供试品未检出梭菌;若供试品平板上有菌落生长,应挑选2~3个菌落分别进行革兰染色和过氧化氢酶试验。

6.4 革兰染色镜检取疑似菌落涂片,作革兰染色、镜检,观察染色及菌体特征。本菌形态特征较为典型。培养后形成的芽孢,初呈“火柴头”状卵圆形,继而膨大呈球形,在菌体末端如鼓槌状。培养时间至72h以上时,菌体可自溶而消失,仅见游离的芽孢囊,一般染色时呈圆圈状。染色镜检有卵圆形至球形的芽孢,大于菌体,着生于菌体中央、次端或顶端,为梭菌典型形态。

6.5 过氧化氢酶试验 加一滴3%过氧化氢溶液至琼脂表面的单个分散的菌落,或转移至载玻片上的菌落上。有气泡形成表示过氧化氢酶反应阳性,梭菌应成阴性结果。可用枯草芽孢杆菌作为阳性反应对照菌。

7 结果判断

若上述可疑菌落为革兰阳性梭菌,有或无卵圆形或球形的芽孢。过氧化氢酶试验阴性,判供试品检出梭菌,否则判供试品未检出梭菌。

8 注意事项

8.1 操作时勿损伤皮肤,若有损伤,应立即注射破伤风抗毒素,以防感染。 8.2 凡带有活菌及毒素的器具,应在彻底灭菌后方可洗涤。

(七)白色念珠菌

1 简述

白色念珠菌(Candida albicans)又名白假丝酵母菌(Saccharomyces albicaus)属假丝酵母菌属(Saccharomyces)。白色念珠茵是条件致病菌,是医学全身性真菌感染病的重要组成之一,一旦感染,常可引起心内膜炎、肺炎、尿布疹、鹅口疮、阴道炎、脑膜炎及败血症等。

白色念珠菌菌细胞呈圆形或卵圆形,直径为3~6um,革兰染色为阳性,但菌体着色不均匀,以出芽方式繁殖,在适宜的培养基上有芽生孢子及假菌丝生长,在假菌丝间其末端形成厚膜孢子。白色念珠菌具有β-硝基半乳糖苷酶,可分解NGL,使对一硝基苯酚游离,在碱性条件下显色。

白色念珠菌广泛分布于土壤、水和空气中,目前国内外的药品、食品标准已把白色念珠菌作为微生物检验中酵母菌的代表菌,因此有些药品依据给药途径和剂型将白色念珠菌作为控制菌是非常必要的。

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