中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法

导读:中国药品检验标准操作规程2010版微生物限度检查法,验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行,在药品中检出大肠埃希菌,口服药品必须检查大肠埃希菌,MUG)和靛基质(indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术,其检验步骤为:增菌培养后,5.2供试品的检验量(见细菌、霉菌及酵母菌计数5.3)5.3供试液的制备(见细菌,阳性对照试验供试品进行控制菌检查时,供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌

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活性,并重新验证。

验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。

(一)大肠埃希菌

1 简述

大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠杆菌,为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外,新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌,随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌。表明该样品受到人和温血动物的粪便污染,即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌,可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保汪人体健康,口服药品必须检查大肠埃希菌。

用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide,MUG)和靛基质(indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术,其检验步骤为:增菌培养后,转种MUG蛋白胨培养基培养,多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌,如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

原理:利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物,产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUD),约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解,产生荧光,由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍,易于观察,没有主观性,因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌基靛基质试验为阳性,故将MUG与靛基质试验结合,比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时,则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。

如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌,专属性不强。 2 仪器、设备及用具(参照细菌、霉菌及酵母菌计数) 3 试液指示液

3.1 0.9%无菌氯化钠溶液(附件二3.1) 3.2 无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)(附件二3.3) 3.3 无菌对氨基苯甲酸溶液(附件二2.2) 3.4 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液(附件二3.2) 3.5 靛基质试液(附件二2.17) 3.6 甲基红试液(附件二4.2) 3.7 V-P试液(附件二2.11,2.13)

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3.8 革兰染色液(附件二2.4,2.10,2.16) 3.9 中性红指示液(附件二4.1) 3.10 亚甲蓝指示液(附件二4.3) 3.11 溴麝香草酚蓝指示液(附件二4.6) 3.12 酸性品红指示液(附件二4.7) 3.13 曙红钠指示液(附件二4.9) 4 培养基

4.1 营养肉汤(附件二5.1) 4.2 营养琼脂(附件二5.2)

4.3 胆盐乳糖(BL)培养基(附件二5.6)

4.4 4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基(附件二5.7)

4.5 乳糖发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基、5%乳糖培养基(附件二5.21,5.22) 4.6 蛋白胨水培养基(附件二5.18)

4.7 磷酸盐葡萄糖胨水培养基(附件二5.19) 4.8 枸橼酸盐培养基(附件二5.20) 4.9 曙红亚甲蓝(EMB)琼脂(附件二5.8) 4.10 麦康凯琼脂(附件二5.9) 5 准备

5.1 对照用菌液(见方法验证)

5.2 供试品的检验量(见细菌、霉菌及酵母菌计数5.3) 5.3 供试液的制备(见细菌、霉菌及酵母菌计数) 6 操作步骤 6.1 检验程序

阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时,应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10~100cfu,供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验 取稀释剂10m1加入100ml(或200 m1)相应控制菌检查用的增菌培养基中,培养,

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应无菌生长。

6.2 增菌培养 取胆盐乳糖(BL)培养基3瓶,每瓶各100ml。2瓶分别加入规定量的供试液(相当于供试品1g、lml、10cm2),其中1瓶加入对照菌10~100个作阳性对照,第3瓶加入与供试液等量的稀释剂作阴性对照。培养18~24h,必要时可延至48h。阴性对照应无菌生长。

取上述培养物0.2ml,接种至含5ml MUG培养基的试管内,培养,于5、24h在366nm紫外光下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照。在紫外光下若管内培养物呈现蓝白色荧光,为MUG阳性;不呈现荧光,为MUG阴性。观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性;呈试剂本色,为靛基质阴性。本底对照的MUG和靛基质试验应为阴性。如MUG阳性、靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌;如MUG阴性、靛基质阴性,判供试品未检出大肠埃希菌。

6.3 分离培养如呈现MUG阳性、靛基质阴性或MUG阴性、靛基质阳性时,应将上述供试品BL增菌培养液轻轻摇动,以接种环沾取1~2环培养液划线于EMB或麦康凯琼脂平板上。培养18~24h。若平板上无菌落生长、或生长的菌落与表1所列的菌落形态特征不符,判供试品未检出大肠埃希菌。

表1 大肠埃希菌菌落形态特征

培养基 曙红亚甲蓝琼脂 麦康凯琼脂 菌落形态 呈紫黑色、浅紫色、蓝紫色或粉红色,菌落中心呈深紫色或无明显暗色中心,圆形,稍凸起,边缘整齐,表面光滑,湿润,常有金属光泽 鲜桃红色或微红色,菌落中心呈深桃红色,圆形,扁平,边缘整齐,表面光滑,湿润 当阳性对照的平板呈典型菌落生长时,若EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列菌落形态特征相符或疑似者,应挑取可疑菌落进行分离、纯化、染色镜检和IMViC试验,确认是否为大肠埃希菌。

为了规范操作,以下是对药典要求的补充。

6.4 纯培养 如EMB或麦康凯琼脂平板上生长的菌落与表1所列特征相符或疑似者,以接种针轻轻接触单个疑似菌落的表面中心,沾取培养物,应挑选2~3个以上疑似菌落,分别接种营养琼脂斜面,培养18~24h,作以下检查。

如平板上无单个可疑菌落,但有可疑菌团(紫黑色,或有金属光泽),应沾取可疑菌团培养物少许,或重新取增菌培养液划线接种于EMB琼脂平板,培养18~24h,再挑选单个疑似菌落,纯培养,作以下检查。

6.5 革兰染色、镜检

6.5.1 以接种环沾取无菌水于洁净载玻片上,取上述疑似菌落的营养琼脂斜面新鲜培养物少许,制成均匀涂片,自然或微温,再通过火焰2~3次干燥使固定。

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6.5.2 滴加结晶紫染液,染色1min,水洗。

6.5.3 滴加碘液,媒染1min,水洗,以滤纸吸干余水。 6.5.4 滴加95%乙醇,脱色20~30s,至流出液无色,水洗。 6.5.5 滴加沙黄染液,复染1min,待干后,镜检。 6.5.6 染色结果

革兰阳性菌呈蓝紫色;革兰阴性菌呈红色。

大肠埃希菌为革兰阴性短杆菌,或球杆菌状,亦有杆菌状。 6.5.7 注意事项

6.5.7.1 玻片必须洁净,无划痕。涂片的菌量宜少,菌液不可过浓。否则,菌细胞成堆或连成片。染色反应难于判断,不利菌细胞的形态观察。

如菌液过浓,须再取洁净载玻片进一步稀释。

6.5.7.2 培养物的菌龄以16~24h为宜。培养时间过长的革兰阳性菌易染成红色。

6.5.7.3 脱色是关键。脱色时间不足,菌细胞易染成阳性;脱色时间过长,菌细胞易染成阴性。 7 生化试验

7.1 乳糖发酵试验 取上述斜面培养物,接种于乳糖发酵管,培养24~48h,观察产酸(指示剂为酸性品红者为红色;指示剂为溴麝香草酚蓝者为黄色),产气(小倒管内有气泡,气泡无论大小都是产气)。

为避免迟缓发酵乳糖产生假阴性,亦可接种5%乳糖发酵管。绝大多数迟缓发酵乳糖的细菌,可于24h出现阳性。或适当延长培养时间。

7.2 靛基质试验(Ⅰ) 取上述斜面培养物,接种于蛋白胨水培养基,培养24~48h,沿管壁加入靛基质试液数滴,轻轻摇动试管,液面呈玫瑰红色为阳性,呈试剂本色为阴性。98%的大肠埃希菌靛基质试验为阳性。一般24h即可出现阳性结果,以无菌操作先从管中取出1或2ml培养液进行检查,如靛基质是阴性,余下的蛋白胨水培养物再培养24h,作靛基质试验。

7.3 甲基红试验(M) 取上述斜面培养物,接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48±2h,于培养液中加入甲基红指示液2~3滴(约每ml培养液加指示液1滴),轻微摇动,立即观察,呈鲜红色或橘红色为阳性,呈黄色为阴性。

7.4 乙酰甲基甲醇生成试验(V-P) 取上述斜面培养物。接种于磷酸盐葡萄糖胨水培养基中,培养48±2h,于2ml培养液中加入α-萘酚乙醇试液1ml,混匀,再加40%氢氧化钾试液0.4ml,充分振摇,在4h(通常在30min)内出现红色应判为阳性,无红色反应为阴性。

7.5 枸橼酸盐利用试验(C) 取上述斜面培养物,接种于枸橼酸盐培养基斜面上,培养2~4天,

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培养基斜面有菌苔生长,培养基由绿色变为蓝色时为阳性,培养基颜色无改变、无菌生长为阴性。

8 结果判断

8.1 当阴性对照试验呈阴性,阳性对照试验MUG呈阳性,供试品MUG阳性、靛基质阳性,报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。MUG阴性、靛基质阴性,报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。

8.2 MUG阳性、靛基质阴性、IMViC试验为-+――、革兰阴性杆菌,报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌;MUG阴性、靛基质阳性、IMViC试验为++――、革兰阴性杆菌,报告1g或1ml供试品检出大肠埃希菌。

8.3 供试品培养物检查不符合8.2二项中的任一项,报告1g或1ml供试品未检出大肠埃希菌。 8.4 当阴性对照有菌生长或阳性对照未生长或生长菌落不是大肠埃希菌,不能做出检验报告。 9 注意事项

9.1 MUG法不必从混合菌中分离单个菌落。除大肠埃希菌外,尚有部分志贺菌属、沙门菌属的菌株;以及少数革兰阳性球菌、杆菌和芽孢菌,其MUG为阳性。因此,在MUG培养基成分中增加了去氧胆酸钠的量,可排除革兰阳性菌的干扰。在胆盐乳糖培养基中志贺菌、沙门菌较难生长。

9.2 配制MUG培养基时,务必校正pH值,灭菌后pH不得过7.4,否则pH值偏高,MUG分解,本身则显荧光;分装MUG培养基的试管应挑选,试管、蛋白胨不得显荧光。

9.3 培养时间 供试品培养液接种于MUG培养基中,一般培养5h和24h要观察是否产生荧光,如荧光很微弱,不能准确判断时,可延长培养至48h再观察结果。由于大肠埃希菌各菌株间的GUD的活性不完全相同,对底物和底物的浓度反应的差异;培养基中选择因子的影响;培养时问、温度;pH值的改变;大量竞争菌和样品本身物质成分的干扰等,对结果的判断亦有影响。

9.4 结果观察 取供试品的MUG试验管、阳性对照管、阴性对照管同时在366nm紫外光灯下观察,阳性对照管应有较强的蓝白色荧光,阴性对照管无荧光。供试品MUG管是否有荧光,应仔细观察比较,或将各管调换位置(阴性管居中),适当倾斜试管。如阳性对照管荧光强烈,影响供试品管与阴性对照管的观察时,亦可移去阳性对照管。

9.5 药品中污染的大肠埃希菌,易受生产工艺及药物的影响。在曙红亚甲蓝琼脂或麦康凯琼脂平板上的菌落形态特征时有变化,挑取可疑菌落往往凭经验,主观性较大,务必挑选2~3个以上菌落分别做IMViC试验鉴别,挑选菌落越多,检出阳性菌的机率越高,如仅挑选一个菌落做IMViC试验鉴别.则易漏检。

9.6 在IMViC试验中,以灭菌接种针沾取菌苔,首先接种于枸橼酸盐琼脂斜面上,然后接种于蛋白胨水培养基、磷酸盐葡萄糖胨水培养基中。切勿将培养基带入枸橼酸盐琼脂斜面上,以免产生假阳性结果。

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