中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法

导读:中国药品检验标准操作规程2010版微生物限度检查法,当标准限度过低或因为操作需要供试品稀释程度过高,不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法见下表3,表3不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法,限度标准cfu∕g,10.6.2供试品检验全过程必须符合无菌技术要求,10.6.3供试液从制备至加入检验用培养基,可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果,11检验报

中国药品检验标准操作规程2010版  微生物限度检查法

中国药品检验标准操作规程2010版 微生物限度检查法

稀释级数和计数测定方法。当标准限度过低或因为操作需要供试品稀释程度过高,可以取较大体积供试液通过薄膜过滤法富集计数测定。不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法见下表3。

表3 不同限度标准宜采用的供试液稀释级及对应宜采用的计数测定方法

限度标准 cfu∕g,ml,10cm 原液 <10 10 100 1000 10000 100000 ■ ●■ ●▲■ 1:10(-1) ■ ■ ●■ ●▲■ ●▲ 2一般2~3个供试液稀释级对应宜选用的计数测定方法 1:102(-2) ■ ●■ ●▲■ ●▲ 1:103(-3) ■ ●■ ●▲ 1:104(-4) ■ ●■ ●:平皿法(供试液体积:1ml∕皿);

▲:平皿法(培养基稀释法供试液体积:<1ml∕皿); ■:薄膜过滤法(供试液体积可以比较灵活)。

10.6.2 供试品检验全过程必须符合无菌技术要求。使用灭菌用具时,不能接触可能污染的任何器物,灭菌吸管不得用口吹吸。

10.6.3 供试液从制备至加入检验用培养基,不得超过1h。否则,可能导致微生物繁殖或死亡而影响计数结果。

10.6.4 供试液稀释及注皿时应取均匀的供试液,以免造成实验误差。 10.6.5 为避免细菌菌落蔓延生长,宜采取下列方法处理:

10.6.5.1 开盖干燥 将已凝固的琼脂平板开盖,倒置斜放于净化工作台上,开机1~2h后合盖,放入培养箱培养。

10.6.5.2 换陶瓦盖 将已凝固的琼脂平板盖换上新近干热灭菌的陶瓦盖。

10.6.5.3 加TTC 于倾注培养基前,在每1000ml营养琼脂内加入灭菌1%TTC溶液1ml(最终浓度为0.001%),混匀后倾注平皿。

11 检验报告书写

本品按《中国药典》2010年版微生物限度检查法标准检验,结果符合或不符合规定。

表4 细菌、霉菌、酵母菌形态特征比较(营养琼脂及玫瑰红钠琼脂平板)

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菌落形态 大小 细菌 差别很大,在同一平板上可出现针尖大小至大于10mm菌落 外观形态 多样,小而突起或大而扁平 白、灰白或无色,亦有淡褐、淡黄及淡红色,菌落正反面颜色相同 透明或不透明 整齐或不整齐。有放射线边缘 状、树枝状、锯齿状、卷发状。低倍镜下一般见不到边缘 一般有臭味 霉菌 酵母菌 一般较大,亦有细小的菌多数直径为1~2mm,在落。在同一平板上生长的同一平板上生长的菌落大菌落大小有时不一致 小有时不一致 培养基表面生长者多为圆多为圆形,有的蔓延生长形,内层生长者为圆形、为无定形 铁饼、纺锤或三角形 小菌落灰白,大菌落形成乳白或粉红色多见,在同孢子后颜色多样。菌落正一平板上色调较单一 反面颜色不同 小菌落半透明有明显折光性,大菌落不透明 透明较差 整齐、低倍下可见球状.卵菌丝体构成,多呈放射状 圆状或假菌丝状.细胞细密排列 往往有霉味 结合较牢固,不易挑起 较慢 多带酒香味 不结合,易挑起 较快 菌 落 色泽 透明度 气味 与培养基结合 不结合 生长速度 细 胞 形态 排列 一般很快 球或杆状,细小均一。高菌丝体相互交织.成熟霉多数为圆或卵圆形,常有倍镜或油镜下可观察形态 菌常有产孢组织及孢子 芽体相连 单个、分散或有一定的排列方式 丝状交织

二、控制菌检查

单个分散 l 简述

控制菌检查是用于检查某些特定微生物(控制菌或其他致病菌),规定按一次检出结果为准,不再复试。

由于控制菌检查为一次性报告实验结果,故应注意方法的有效性确证(方法验证或阳性对照)、实验过程保障和结果确证,以提高检验结果的可靠性。既要避免漏检造成的假阴性结果。也要避免实验室污染造成的假阳性结果。

控制菌检查中,涉及实验室监控菌株的分离鉴定、样品阳性菌株的分离分析、方法验证试验中的阳性菌操作等,应在专门的阳性菌实验室进行。除另有规定外,阳性菌实验室应符合国家Ⅱ级生物安全标准,阳性菌实验室应配备生物安全柜。阳性菌操作不得在供试品检验用洁净实验室内进行。

2 方法验证

在建立供试品的控制菌检查法或原检查法的检验条件发生改变可能影响检验结果的准确性时,应对

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供试品的抑菌活性及检查法的可靠性进行验证。验证时.按各供试品微生物限度项下的规定(给药途径)选择相应的菌株,并按供试液的制备和控制菌检查法所规定的方法进行。

2.1 仪器、设备及用具 见各控制菌检查项下。 2.2 试液、指示液 见各控制菌检查项下。 2.3 培养基

见各控制菌检查项下。 2.4 方法验证用标准菌株

应根据具体品种项下的目标控制菌选择相应的验证用标准菌株,常用目标控制菌的标准菌株如下: 大肠埃希菌Escherichia coli [CMCC(B) 44102]

金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus [CMCC(B) 26003] 乙型副伤寒沙门菌Salmonella paratyphi B [CMCC(B) 50094] 铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa [CMCC(B) 10104] 生孢梭菌Clostridium sporogenes [CMCC(B)64941] 白色念珠菌Candida albicans [CMCC(F) 98001]

菌液制备取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、乙型副伤寒沙门菌、铜绿假单胞菌培养物少许,接种至l0ml营养肉汤培养基内,置30~35℃培养18~24h,取均匀培养物1ml,用0.9%无菌氯化钠溶液稀释成每1ml含菌10~100cfu的菌悬液,其菌数在做对照试验的同时用营养琼脂注皿或平板涂布,经培养后计数确定。生孢梭菌接种至12ml硫乙醇酸盐流体培养基中,置30~35℃培养18~24h,用0.9%无菌氯化钠溶液制成1ml含10~100cfu的菌液。

2.5 供试液的制备(见细菌、霉菌及酵母菌计数) 2.6 验证方法

2.6.1 试验组取规定量供试液和10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,按相应控制菌的检查法进行检查。当采用薄膜过滤法时,试验菌应加在最后一次冲洗液中,冲洗后,取出滤膜接至增菌培养基中。

2.6.2 阳性对照 取10~100cfu试验菌加入增菌培养基中,按相应控制菌的检查法进行检查。 2.6.3 阴性对照取相应的稀释液替代供试液,按相应控制菌的检查法进行检查。 2.7 结果判定

阳性对照组应检出试验菌,阴性对照组应无菌生长。若试验组检出试验菌,按此供试液制备法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查;若试验组未检出试验菌,应建立新的方法,消除供试品的抑菌

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活性,并重新验证。

验证试验可与供试品的控制菌检查同时进行。

(一)大肠埃希菌

1 简述

大肠埃希菌(Escherichia coli)即大肠杆菌,为肠杆菌科埃希菌属的模式种。埃希菌属除大肠埃希菌外,新近发现有非脱羧埃希菌等5个种。大肠埃希菌是人和温血动物肠道内的栖居菌,随粪便排出体外。在药品中检出大肠埃希菌。表明该样品受到人和温血动物的粪便污染,即可能污染肠道病原体。大肠埃希菌除普通大肠埃希菌外尚有致病性大肠埃希菌,可引起婴幼儿、成人爆发性腹泻。为保汪人体健康,口服药品必须检查大肠埃希菌。

用4-甲基伞形酮葡糖苷酸(4-Methylumbelliferyl-β-D-glucuronide,MUG)和靛基质(indole)试验检查大肠埃希菌是一项新技术,其检验步骤为:增菌培养后,转种MUG蛋白胨培养基培养,多数情况下不需要从混合菌中分离单个菌,如MUG、Indole试验为阳性或阴性即可报告结果。

原理:利用目标菌限定酶作用的底物的水解产物,产生颜色或荧光反应作为指示系统来鉴定目标菌。 实验证明96%的大肠埃希菌含β-葡糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUD),约10%的沙门菌属一些菌种也含有此酶。MUG被GUD水解,产生荧光,由于荧光反应的敏感度较颜色反应强千万倍,易于观察,没有主观性,因而用MUG鉴定大肠埃希菌已被广泛应用于临床、食品、饮水、污水等的检测。单一的MUG鉴别大肠埃希菌其漏检率达6%,鉴于98%的大肠埃希菌基靛基质试验为阳性,故将MUG与靛基质试验结合,比单用MUG可提高大肠埃希菌的检出率。如MUG与Indole试验的反应不一致时,则需将供试液的增菌培养物用EMB琼脂平板分离培养、革兰染色、镜检及生化试验鉴别。该法理论上可使大肠埃希菌的检出率达98%。

如仅用IMViC生化试验来鉴别大肠埃希菌属中的大肠埃希菌,专属性不强。 2 仪器、设备及用具(参照细菌、霉菌及酵母菌计数) 3 试液指示液

3.1 0.9%无菌氯化钠溶液(附件二3.1) 3.2 无菌磷酸盐缓冲溶液(pH7.2)(附件二3.3) 3.3 无菌对氨基苯甲酸溶液(附件二2.2) 3.4 无菌聚山梨酯80氯化钠溶液(附件二3.2) 3.5 靛基质试液(附件二2.17) 3.6 甲基红试液(附件二4.2) 3.7 V-P试液(附件二2.11,2.13)

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3.8 革兰染色液(附件二2.4,2.10,2.16) 3.9 中性红指示液(附件二4.1) 3.10 亚甲蓝指示液(附件二4.3) 3.11 溴麝香草酚蓝指示液(附件二4.6) 3.12 酸性品红指示液(附件二4.7) 3.13 曙红钠指示液(附件二4.9) 4 培养基

4.1 营养肉汤(附件二5.1) 4.2 营养琼脂(附件二5.2)

4.3 胆盐乳糖(BL)培养基(附件二5.6)

4.4 4-甲基伞形酮葡糖苷酸蛋白胨培养基(附件二5.7)

4.5 乳糖发酵培养基、乳糖胆盐发酵培养基、5%乳糖培养基(附件二5.21,5.22) 4.6 蛋白胨水培养基(附件二5.18)

4.7 磷酸盐葡萄糖胨水培养基(附件二5.19) 4.8 枸橼酸盐培养基(附件二5.20) 4.9 曙红亚甲蓝(EMB)琼脂(附件二5.8) 4.10 麦康凯琼脂(附件二5.9) 5 准备

5.1 对照用菌液(见方法验证)

5.2 供试品的检验量(见细菌、霉菌及酵母菌计数5.3) 5.3 供试液的制备(见细菌、霉菌及酵母菌计数) 6 操作步骤 6.1 检验程序

阳性对照试验 供试品进行控制菌检查时,应做阳性对照试验。阳性对照试验的加菌量为10~100cfu,供试品和增菌培养基用量及检查按供试品的控制菌检查。阳性对照试验应检出相应的控制菌。

阴性对照试验 取稀释剂10m1加入100ml(或200 m1)相应控制菌检查用的增菌培养基中,培养,

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