紫色马铃薯查尔酮合成酶基因_CHS_的克隆及分析_图文

导读:紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析,摘要:【目的】从紫色马铃薯中克隆CHS的cDNA全长序列,并分析其组织表达水平以及诱导剂处理后基因的表达与花青素含量积累之间的关系,【方法】采用RT-PCR和RACE方法克隆紫色马铃薯CHS的cDNA全长序列,通过在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析,半定量RT-PCR检测StCHS在紫色马铃薯组织中的表达特异性以及蔗糖和赤霉素处,采用分光光

紫色马铃薯查尔酮合成酶基因_CHS_的克隆及分析_图文

中国农业科学 2012,45(5):832-839 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2012.05.002

紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析

胡朝阳,周友凤,龚一富,金 思,王何瑜,赵群芬

(宁波大学海洋学院/教育部应用海洋生物重点实验室,浙江宁波 315211)

摘要:【目的】从紫色马铃薯中克隆CHS的cDNA全长序列,并分析其组织表达水平以及诱导剂处理后基因的表达与花青素含量积累之间的关系。【方法】采用RT-PCR和RACE方法克隆紫色马铃薯CHS的cDNA全长序列,通过在线软件进行核苷酸序列和氨基酸序列分析,半定量RT-PCR检测StCHS在紫色马铃薯组织中的表达特异性以及蔗糖和赤霉素处理后StCHS的表达。采用分光光度计法测定紫色马铃薯花青素含量。【结果】克隆获得紫色马铃薯

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CHS的cDNA全长1 490 bp,包含1 170 bp的ORF,该基因编码389个氨基酸。推测StCHS蛋白含有Cys、Phe、

His303和Asn336 4个活性位点,构成CHS蛋白的催化中心。StCHS的表达具有组织特异性,在茎、叶柄和叶中表达较强,在根、块茎和叶轴中几乎检测不到CHS的表达。赤霉素能促进CHS的表达从而促进花青素的积累;蔗糖能够显著促进紫色马铃薯花青素的积累,但对CHS的表达影响不明显。【结论】从紫色马铃薯中克隆获得CHS的cDNA全长序列,该基因表达具有组织特异性,StCHS是紫色马铃薯花青素合成途径中的一个限速酶基因。

关键词:紫色马铃薯;查耳酮合成酶基因;花青素;赤霉素;蔗糖;基因表达

Cloning and Expression Analysis of a Chalcone Synthase (CHS)

Gene from Purple Potato (Solanum tuberosum)

HU Chao-yang, ZHOU You-feng, GONG Yi-fu, JIN Si, WANG He-yu, ZHAO Qun-fen

(Faculty of Marine Science, Ningbo University/Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology, Ministry of Education,

Ningbo 315211, Zhejiang)

Abstract: 【Objective】 The aim of this study was to clone the full length cDNA of chalcone synthase from purple potato, to analyze its expression at different organs and the relationship between CHS expression and anthocyanin accumulation after treated with different concentrations of GA3 and sucrose. 【Method】 The full-length cDNA of CHS was isolated from Solanum tuberosum by RT-PCR and RACE. Semi-quantitative RT-PCR was used to analyze the expression levels of StCHS in different organs, and the expression levels induced by GA3 and sucrose were adopted by semi-quantitative RT-PCR. The anthocyanin content of purple potato was measured by spectrophotometer method. 【Result】 The cloned full-length CHS was 1 490 bp in length, containing a 1 170 bp open reading frame (ORF), which encodes 389 amino acids. The deduced amino acids contained Cys164, Phe215, His303, and Asn336 active sites, which constitute the catalytic center of CHS. CHS is expressed at different levels in different organs, which was found to be expressed in stems, leaf stalks and leaves but not in roots, tubers or rachises. The anthocyanin accumulation was slightly induced by GA3 as well as the expression of CHS. The anthocyanin accumulation was strongly induced by sucrose, but the CHS expression was not notably induced. 【Conclusion】CHS gene was cloned from purple potato and its expression is tissue-specific. StCHS is a rate-limited gene in the flavonoid synthesis pathway of purple potato.

Key words: purple potato (Solanum tuberosum); chalcone synthase gene (CHS); anthocyanin; GA3; sucrose; gene expression 收稿日期:2011-08-31;接受日期:2011-10-31 基金项目:宁波市农业创新创业资金(2010C91050)、宁波市农业科技攻关(2010C10051,2010C10057)、宁波大学学科项目(XKL121,XKL11D2099)、

宁波市科技林特与食品加工科技特派团队项目

联系方式:胡朝阳,Tel:0574-87600878;E-mail:spiritsun85@163.com。通信作者龚一富,Tel:0574-87600878;E-mail:gongyifu@163.com

5期 胡朝阳等:紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析 833

0 引言

【研究意义】花青素是植物体内重要的次级代谢产物,具有许多重要的生物学功能,如抵御病原微生物入侵、促进豆科植物根瘤形成及保护植物免受紫外线伤害[1-2]等。由于花青素具有很高的抗氧化活性,可被人类用作营养物质[3]和抗癌物质[4-5]。查尔酮合成酶基因(chalcone synthase,EC 2.3.1.74;CHS)是紫色马铃薯花青素合成途径的第一个关键酶基因,与紫色马铃薯花青素的形成关系密切,了解其结构特征、表达调控方式及与花青素在块茎中合成和积累的关系,有助于弄清紫色马铃薯花青素积累的分子机理。【前人研究进展】查尔酮合成酶催化丙二酰辅酶A(malony CoA)与对羟基苯丙烯酰辅酶A(coumaryc CoA)缩合成四羟基查尔酮(naringenine chalcone)[6]。目前,许多CHS已从双子叶植物、单子叶植物以及裸子植物中被克隆,如温州蜜柑、百合、洋葱、高粱、野葛、拟南芥、银杏等[7-12]。CHS表达量的改变可导致花色的改变,采用抑制CHS的表达量来改变矮牵牛花色的研究比较深入。Courtney- Gutterson等[13]将菊花正义CHS和反义CHS导入开粉红色花的菊花中,分别获得了开浅红色和白色花的转基因植株,说明CHS是影响花青素积累的一个关键酶基因。CHS的表达能被不同的外源刺激和植物发育不同阶段的内源性因子以及组织特异性所调控。Pang等[14]用UV-B和伤害分别处理银杏叶片1 h和48 h,其CHS表达显著增强;De León等[15]研究表明软腐病菌和灰霉菌能诱导小立碗藓CHS的表达,从而增强其抵抗病菌的能力。程龙军等[16]研究表明赤霉素、蔗糖和光照等信号分子可通过诱导花青素生物合成中的一些基因的表达来提高花青素的含量。Weiss等[17]研究表明,GA3可诱导矮牵牛CHS的表达来影响花青素的积累。【本研究切入点】目前,植物花青素生物合成的基因表达、信号传导与调控的研究集中在花器官,但对块茎等地下部位花青素的积累鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究拟采用RT-PCR和RACE方法克隆获得CHS的cDNA全长序列,建立半定量RT-PCR反应体系及花青素含量的测定方法。

1 材料与方法

1.1 植物材料和处理

紫色马铃薯试管苗由宁波大学海洋学院植物组织培养实验室保存。赤霉素和蔗糖对紫色马铃薯花青素

含量和CHS表达的影响试验于2009年4月在宁波大学海洋学院植物组织培养实验室进行。

赤霉素和蔗糖对紫色马铃薯CHS表达影响试验:将根长1 cm左右、茎长8 cm左右的试管苗从MS培养基中取出,洗净培养基,把根浸没于蒸馏水中培养3 d,再分别用不同浓度的赤霉素和蔗糖处理,12 h后提取RNA做半定量RT-PCR。赤霉素和蔗糖对紫色马铃薯花青素含量影响试验:试管苗在添加不同浓度赤霉素或蔗糖的MS培养基中培养,30 d后测其花青素含量。赤霉素浓度分别为0、0.5、1.0、2.0和4.0 mg·L-1,蔗糖浓度分别为0、30、60、90和120 g·L-1。CHS组织特异性表达研究:试管苗先在花盆中栽培30 d,然后提取根、茎、叶、叶柄、叶轴和块茎6个组织的RNA,做半定量RT-PCR。 1.2 CHS的全长cDNA克隆

采用Trizol试剂(Invitrogen,USA)提取RNA。取5 μL总RNA用oligo(dT)17为引物按照说明书(SMARTTM,Clontech,USA)进行反转录。RNaseH处理后,单链的cDNA混合物作为扩增核心序列的模板。用FCHS(5′-TCTTCGTTCACGTAGTACTAAAC -3′)和RCHS(5′-TTTATTAGGTATTTGATTACAT AG-3′)为引物扩增StCHS核心序列。根据扩增得到的核心序列,设计扩增5′UTR和3′UTR的引物:CHS5-1(5′-TGCCTCTTTGCCAAGTTTAG-3′)和CHS5-2(5′-GTGCCTTACGATACTCCTCC-3′)以及CHS3-1(5′-CAATATGTCAAGTGCCTGTGTG-3′)和CHS3-2(5′-AGTGTTGCTACTTAGTGGGTTGG-3′)。按照美国Clontech公司的RACE试剂盒进行5′RACE和3′RACE。PCR扩增测序后用Vector NTI Suite 8.0软件拼接出CHS全长。 1.3 生物信息学分析

StCHS的开放阅读框(ORF)、一级结构以及序列比对(BLAST)都在NCBI网站(http://www.ncbi. nlm.nih.gov)进行,StCHS蛋白的分子量与等电点预测应用Computer pI/MW Tool软件(http://www.expasy. org)。StCHS的二级结构在SOPMA服务器(http://cn. expasy.org/tools/)上完成[18]。蛋白质三维模型的同源建模使用http://www.expasy.org网站提供的相关生物信息学分析软件进行。CHS系统进化树用生物信息学软件Clustal W(1.82)和MEGA version 4.1。 1.4 半定量RT-PCR分析

设计1对特异性引物fchs(5′-CATGGAGGAGT ATCGTAAGGCAC-3′)和rchs(5′-TCACTGGGTCCA

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CGGAATGT-3′)进行半定量PCR。选用actin为内参,引物序列为actinF(5′-CGTCGCTATTCAGGCAGTC -3′)和actinR(5′-CAGCTTCCATTCCCACAAG-3′)。按日本TaKaRa公司的一步法RT-PCR试剂盒说明书进行PCR,扩增循环数为28个循环。 1.5 花青素含量测定

花青素含量测定参照Dedaldechamp等[19]的方法,并稍加修改。取0.1 g试管苗,磨碎后加入10 mL酸性乙醇(添加0.1% HCl),28℃孵育18 h。然后10 000 r/min离心10 min,取上清,测出530 nm和657 nm处吸光值,花青素含量可以表示为:Q=A530-0.25A657(mg·g-1·FW-1)。

2.1 StCHS的克隆与序列分析

PCR扩增得到1 025 bp的核心序列,通过RACE得到500 bp的3′端序列和167 bp的5′端序列。用Vector NTI Suite 8.0软件将3′端序列、5′端序列和核心序列拼接得到1 490 bp的StCHS全长。把基因全长序列输入NCBI网站的ORF Finder程序,结果显示,StCHS包含1 170 bp ORF、184 bp 3′UTR和136 bp 5′UTR(图1)。

BLAST显示,克隆得到的紫色马铃薯CHS的cDNA序列与野生马铃薯(AY954033.1)、西红柿(AK327204.1)、烟草(FJ969392.1)和杂交矮牵牛(AF233638.1)的同源性分别为96%、95%、89%和88%。

2.2 StCHS蛋白质分析

StCHS编码一个由389个氨基酸组成的蛋白质,

2 结果

粗体下划线表示起始密码子,粗体斜体下划线表示终止密码子,阴影表示poly(A)尾

The start codon (ATG) was underlined in bold and the stop codon (TGA) was italically underlined in bold. The poly (A) tail was painted with shadow

图1 紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)全长cDNA序列及预测的氨基酸序列

Fig. 1 The full-length cDNA sequence and the deduced amino acid sequence of Solanum tuberosum chalcone synthase

5期 胡朝阳等:紫色马铃薯查尔酮合成酶基因(CHS)的克隆及分析 835

分子量大小为42.46 kD,等电点(pI)6.72。StCHS蛋白二级结构预测结果显示,有166个氨基酸参与形成α-螺旋(alpha helix),占所有氨基酸的42.67%,有69个氨基酸参与形成伸展链(extended strand),占总氨基酸的17.74%,另有125个氨基酸参与形成无规卷曲(random coil),占总氨基酸的32.13%。

为更进一步了解该CHS蛋白的特征,通过使用SWISS-MODEL[20]根据紫花苜蓿CHS晶体进行同源建模获得了紫色马铃薯CHS蛋白的三维结构模型(图2)。三级结构中包括Cys164、Phe215、His303、Asn336 4个活性位点,并且这4个活性位点在三级结构上是相邻的,构成CHS蛋白的催化中心,这与对紫花苜蓿(Medicago sativa)的CHS晶体结构进行研究得到的其4个活性位点完全相同[21]。同时得到的StCHS蛋白还具有5个袋状桂皮酰结合位点Ser133、Glu192、Thr194、Thr197和Ser338以及7个袋状环化位点Thr132、Met137、Phe215、Ile254、Gly256、Phe265和Pro375。

为了解StDXS和其它植物DXS之间的进化关系,使用Clustal X软件和MEGA4软件构建了几种不同植物CHS蛋白的系统进化树。结果(图3)表明,紫色

1、2、3、4分别为StCHS蛋白的4个活性位点Cys164、Phe215、His303和Asn336

1, 2, 3 and 4 represent four active sites of StCHS Cys164, Phe215, His303, and Asn336, respectively

图2 StCHS蛋白质三维结构模型 Fig. 2 The 3-D model structure of StCHS

马铃薯和烟草(Nicotiana tabacum)同属于茄科,在进化树中聚为一个分支,表明两者亲缘关系最接近,这与植物分类结果是一致的。

图3 用植物CHS氨基酸序列构建的系统进化树

Fig. 3 Molecular phylogenetic tree of the deduced amino acid sequences of CHSs from plants

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