参慈胶囊联合顺铂通过PI3K_A_省略_路逆转人肺腺癌顺铂耐药的机制研究_徐立群

导读:参慈胶囊联合顺铂通过PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转人肺腺癌顺铂耐药的机制研究,广州肿瘤研究所,要]目的:探讨参慈胶囊联合顺铂是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转接种,随机分为对照组、参慈胶囊组、顺铂组和参慈胶囊+顺铂组,结果:参慈胶囊组、顺铂组和参慈胶囊+顺铂组与对照组比较,其中参慈胶囊+顺铂组较其它治疗组能够进一步将人肺腺癌A549/DDP细胞阻滞于G,结论:参慈胶囊可能

参慈胶囊联合顺铂通过PI3K_A_省略_路逆转人肺腺癌顺铂耐药的机制研究_徐立群

·500·

33(3):500-504中国病理生理杂志ChineseJournalofPathophysiology2017,

杂志网址:http://www.cjpp.net

[文章编号]1000-4718(2017)03-0500-05

参慈胶囊联合顺铂通过PI3K/AKT/mTOR信号通路

*

逆转人肺腺癌顺铂耐药的机制研究

12

徐立群△,张荣华,邹

1311

莹,潘静洁,邬晓东,于礼建,梁

2

1

(1广州医科大学附属肿瘤医院,广州肿瘤研究所,广东广州510095;

广东广州510632;

[摘

3

暨南大学药学院,

广州市胸科医院,广东广州510095)

要]目的:探讨参慈胶囊联合顺铂是否通过PI3K/AKT/mTOR信号通路逆转接种人肺腺癌A549/DDP

细胞的裸鼠体内的顺铂耐药。方法:建立裸鼠人肺腺癌移植瘤模型,随机分为对照组、参慈胶囊组、顺铂组和参慈胶囊+顺铂组。对照组予生理盐水,其余各组荷瘤裸鼠均用药21d,断颈处死,取肿瘤组织,采用流式细胞术检测PCR技术检测A549/DDP肺癌组织PTEN、P-PI3K、AKT和mTOR的mRNA糖蛋白、细胞周期与细胞凋亡;采用FQ-表达情况。结果:参慈胶囊组、顺铂组和参慈胶囊+顺铂组与对照组比较,对人肺腺癌A549/DDP细胞的增殖均有抑制作用,其中参慈胶囊+顺铂组较其它治疗组能够进一步将人肺腺癌A549/DDP细胞阻滞于G2/M期,促进细胞PI3K、AKT和mTOR的表达。结论:参慈胶囊可能通过阻断PI3K/AKT/凋亡,增加PTEN的表达,抑制P-糖蛋白、mTOR信号通路,促进PTEN的表达,或者抑制P-糖蛋白介导的耐药途径,增强裸鼠体内人肺腺癌A549/DDP耐药细胞对顺铂的敏感性。

[关键词]肺癌;参慈胶囊;顺铂耐药;PI3K/AKT/mTOR信号通路;PTEN;P-糖蛋白[中图分类号]R730.23

[文献标志码]A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2017.03.019

MechanismofShencicapsulecombinedwithcisplatininreversingDDP

resistanceofhumanlungadenocarcinomaviaPI3K/AKT/mTORsigna-lingpathway

XULi-qun1,ZHANGRong-hua2,ZOUYing1,PANJing-jie3,WUXiao-dong1,YULi-jian1,LIANGKun1

(1AffiliatedCancerHospital&InstituteofGuangzhouMedicalUniversity,GuangzhouInstituteofOncology,Guangzhou510095,China;

2

PharmacyCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;

3

GuangzhouChestHospital,Guang-

mail:xuliqun99@163.com)zhou510095,China.E-[ABSTRACT]AIM:ToinvestigatetheeffectofShencicapsulecombinedwithcisplatin(DDP)inreversingDDPresistancebyPI3K/AKT/mTORsignalingpathwayinnudemicebearingA549/DDPtumor.METHODS:Thepatient-de-rivedlungadenocarcinomaA549/DDPcellxenograftmodelwasestablished.Thetumor-bearingnudemicewererandomlydividedintocontrolgroup,Shencicapsulegroup,DDPgroupandShencicapsulecombinedwithDDPgroup.Themiceinwhilethemiceinothergroupsweretreatedwithdifferentdrugsfor21d.Aftercontrolgroupwastreatedwithnormalsaline,

treatment,themicewerekilledandlungcancertissueswerecollected.Flowcytometrywasusedtoanalyzethecellcycleandapoptosis.FQ-PCRwasusedtodeterminedthemRNAlevelsofPTEN,P-glycoprotein,PI3K,AKTandmTORinthecellproliferationinallthedrugtreatmentgroupswasA549/DDPlungtumor.RESULTS:Comparedwithcontrolgroup,

inhibited.Comparedwithotherdrugtreatmentgroups,ShencicapsulecombinedwithDDPblockedthecellcycleofA549/DDPcellsatG2/Mphase,promotedtheapoptosisrate,increasedthemRNAexpressionofPTENandinhibitedthemRNAexpressionofP-glycoprotein,PI3K,AKTandmTOR.CONCLUSION:ShencicapsuleincreasesthesensitivityofA549/DDPresistantcellsinnudemicetoDDPbyblockingPI3K/AKT/mTORsignalingpathway,increasingtheexpressionofPTENorinhibitingP-glycoprotein-mediatedresistancepathway.[收稿日期]2016-07-18

[修回日期]2016-12-13

*[基金项目]广东省中医药局科研项目(No.20141176;No.20151279)66673660;E-mail:xuliqun99@163.com△通讯作者Tel:020-

·501·

[KEYWORDS]Lungcancer;Shencicapsule;DDPresistance;PI3K/AKT/mTORsignalingpathway;PTEN;P-glycoprotein

small-celllungcan-化疗在非小细胞肺癌(non-NSCLC)的综合治疗中占据重要地位,cer,但多药耐MDR)的产生仍是导致化疗药(multidrugresistance,

失败的主要原因。磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/

TGCGATAGCAGGAGTGGTTG-3’,-下游引物为5’,TCTGCAAGCTCTGGGCATAC-3’扩增片段大小173bp。PI3K上游引物为5’-ACCATGGTGCTTGTTA-ACGC-3’,-GTGGGTTGTTGGTTGCT-下游引物为5’

ki-GAC-3’,哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphatidylinositol3-扩增片段大小327bp。AKT上游引物为

nase/proteinkinaseB/mammaliantargetofrepamycin,5’-CATGCAGCACCGGTTCTTTG-3’,-下游引物为5’PI3K/Akt/mTOR)信号通路与恶性肿瘤的侵袭、转移

[1-2]

。参慈胶囊由名方仙及多药耐药有密切的关系

鱼汤化裁而来,临床证实对NSCLC具有较好的疗效,配合化疗具有减毒增效的作用。前期研究显示参慈胶囊联合顺铂(cisplatin,DDP)能够通过调节DNA损伤修复系统,改善接种人肺腺癌A549/DDP

[4]

细胞的裸鼠体内的顺铂耐药状态。但PI3K/AKT/mTOR是否参与这一过程,目前尚缺乏实验研究。本

[3]

,TCAGGTTCAGATGATCCATGCG-3’扩增片段大小318bp。mTOR上游引物为5’-TTTGGCCTGGTGAA-CACACT-3’,下游引物为5’-GACCATCGACATA-ACGGCCA-3’,actin上游引扩增片段大小387bp。β--CTTCCTTCTTGGGTATGGAATCC-3’,物为5’下游引

-GGAGCAATGATCTTGATCTTCATG-3’,扩增物为5’

片段大小205bp。

2方法2.1

根据参考文献在无菌条件下取下荷

瘤裸鼠瘤块,切成约1mm×1mm×1mm,通过穿刺

进行造模。针刺入裸鼠的右前腋下,

造模

[4]

[4]

研究从PI3K/AKT/mTOR信号通路出发,探讨参慈

胶囊联合DDP对接种人肺腺癌A549/DDP细胞的裸鼠体内顺铂耐药的影响,以进一步分析参慈胶囊逆转肺腺癌多药耐药的机制。

2.2

1材料

1.1实验药物

料和方法

分组与处理根据参考文献将接种人肺腺癌细胞A549/DDP瘤块的裸鼠,随机分为对照组、参慈胶囊组、顺铂组和参慈胶囊+顺铂组,每组10只。对照组予以0.2mL生理盐水灌胃,其余各组分别予相应药物干预,连续用药21d后脱颈处死,分离肿瘤

(1)参慈胶囊由党参25g、山慈菇

10g、田七片10g、守宫5g、山海螺30g、仙鹤草15g、猫爪草30g等11味中药组成,由广州一方制药集

经浓煎、水提、乙醇沉淀,并进一步团提供免煎颗粒,

浓缩而成。(2)DDP为江苏豪森药业股份有限公司

产品,由本院药房提供。1.2

4~6周龄,实验动物BALB/c裸鼠50只,雌雄各半,体重18~22g,实验动物合格证号为

行病理鉴定后进行实验指标检测。组织,

2.3用流式细胞术检测各组肿瘤组织细胞周期情况及细胞凋亡情况取新鲜肺肿瘤组织,用PBS液

9

制成单细胞悬液,调整细胞数为1×10/L;加入冲洗,

70%的乙醇4℃固定12h;PBS液冲洗2次;加入RNaseA(终浓度50mg/L),37℃孵育30min;加入PI

(终浓度为50mg/L),4℃避光染色30min后上机检

44007200010919,由广东省医学实验动物中心提供,测;用CellQuest软件分析各组细胞的周期分布,分析SPF级别。G0/G1期、S期和G2/M期细胞所占比例;AnnexinV-1.31.4

人肺腺癌A549/DDP耐药细胞由广东省医学实验动物中心提供。

细胞来源

主要试剂和仪器胰蛋白酶为Sigma产品;RT-PCR试剂盒及TRIzol为TaKaRa产品;ABI7500Fast荧光定量PCR仪为LifeTechnologies产品;FAC-引物设计引物序列根据GenBank人类各目的基因cDNA序列,由广州华银医学检验中心有限

FITC/PI法测定细胞凋亡,并计算凋亡百分率。

2.4用荧光定量PCR(FQ-PCR)技术检测PTEN、P-gp、PI3K、AKT和mTORmRNA的表达情况A549/

DDP肺癌组织100mg匀浆后加入TRIzol试剂提取60℃34s,总RNA。反应条件:95℃30s;95℃5s,

进行40个循环,在ABI7500实时定量PCR系统上进行,收集反应荧光信号,并建立PCR产物的熔解曲

-Ct

线。实验重复3次。数据采用2ΔΔ法,计算每1μLcDNA所含目的基因的拷贝数与1μLcDNA所含β-actin的拷贝数的比值,进行半定量比较。3

统计学处理

采用SPSS15.0软件进行统计学分析,实验数据

Scan型流式细胞仪为BD产品。1.5

-公司合成。引物设计如下。PTEN上游引物为5’

AACATGCAGGCTTCTGAGGG-3’,-下游引物为5’AAATCCACACACAAGCCACT-3’,扩增片段大小148bp。P-glycoprotein,P-gp)上游引物为5’-糖蛋白(P-

·502·

以均数±标准差(mean±SD)表示,多组比较采用单

wayANOVA),组间两两比较,采因素方差分析(one-用Bonferroni校正的t检验,以P<0.05为差异有统

计学意义。

癌A549/DDP细胞周期的影响

各治疗组与对照组比较,肺癌细胞增殖均受到抑制,其中参慈胶囊+顺铂组与其它治疗组比较,细胞明显阻滞于G2/M期,而处于S期的细胞数目则明显减少,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。

1

采用流式细胞术分析参慈胶囊与顺铂对人肺腺

表1

GroupControlShencicapsuleDDP

Shencicapsule+DDP

**

各组人肺腺癌A549/DDP细胞周期的变化

G2/M16.30±3.40

*25.90±2.92**

26.20±2.66**

38.20±2.10*

Table1.EffectsofShencicapsule,aChinesemedicineandDDPoncellcycleinA549/DDPcelllines(%.Mean±SD.n=10)

G0/G155.30±2.75

51.00±1.49**

49.20±1.93**

43.40±2.41*#

S28.90±2.73

*#

23.10±2.77**##

24.60±3.84**

18.40±3.27*

P<0.01vscontrolgroup;P<0.05,##P<0.01vsShencicapsule+DDPgroup.

2

采用流式细胞术分析参慈胶囊与顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的影响治疗组出现亚二倍体凋亡峰,凋亡细胞的数量明显增多,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。参慈胶囊组、顺铂组与参慈胶囊+顺铂组比较,差异具有统计学意义(P<0.01),见图1、表2。

流式细胞术分析人肺腺癌A549/DDP细胞DNA

的含量,结果显示对照组亚二倍体凋亡峰不明显,各

Figure1.ApoptosisofA549/DDPcellinvariousgroupsdetectedbyflowcytometry.图1

各组人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡图

3

参慈胶囊与顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织PTENmRNA表达的影响

各治疗组与对照组比较,人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织PTENmRNA的表达均增加,其中参慈胶囊+顺铂组与其它治疗组比较,PTENmRNA的增

加更为明显,差异具有统计学意义(P<0.01),见表3。

4参慈胶囊与顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞移gpmRNA表达的影响植瘤组织P-各治疗组与对照组比较,人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织P-gpmRNA的表达均降低,其中参

·503·

表2

各组人肺腺癌A549/DDP细胞凋亡的变化

表5

各组人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织PI3KmRNA的表达

Table5.EffectsofShencicapsuleandDDPontheexpressionof

PI3KmRNAinA549/DDPcellxenograft(Mean±SD.n=10)Group

Control

ShencicapsuleDDP

Shencicapsule+DDP

**

Table2.EffectsofShencicapsuleandDDPonapoptosisrateof

A549/DDPcells(Mean±SD.n=10)GroupControlShencicapsuleDDP

Shencicapsule+DDP

**

Apoptosisrate(%)5.90±1.10

*##

10.10±1.66**##

11.40±1.35**

19.80±2.86*##

PI3KmRNA3.47±0.30

*##

2.15±0.42*

*##

2.11±0.25*

1.35±0.26*##

P<0.01vscontrolgroup;P<0.01vsShencicapsule+

DDPgroup.表3

各组人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织PTENmRNA的表达

Table3.EffectsofShencicapsuleandDDPontheexpressionof

PTENmRNAinA549/DDPcellxenograft(Mean±SD.n=10)GroupControlShencicapsuleDDP

Shencicapsule+DDP

**

P<0.01vscontrolgroup;P<0.01vsShencicapsule+

DDPgroup.

各治疗组与对照组比较,人肺腺癌A549/DDP

细胞移植瘤组织AKTmRNA的表达均降低,其中参

AKTmRNA的慈胶囊+顺铂组与其它治疗组比较,

表达进一步降低,差异具有统计学意义(P<0.01),

见表6。

表6

各组人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织AKTmRNA的表达

Table6.EffectsofShencicapsuleandDDPontheexpressionof

AKTmRNAinA549/DDPcellxenograft(Mean±SD.n=10)GroupControlShencicapsuleDDP

Shencicapsule+DDP

**

PTENmRNA1.38±1.90

*##

2.16±00.38*

2.13±0.453.40±0.58

##

**##**

P<0.01vscontrolgroup;P<0.01vsShencicapsule+

DDPgroup.

P-gpmRNA的慈胶囊+顺铂组与其它治疗组比较,

表达进一步降低,差异具有统计学意义(P<0.01),见表4。

表4

gp各组人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织P-mRNA的表达

Table4EffectsofShencicapsuleandDDPontheexpressionof

P-gpmRNAinA549/DDPcellxenograft(Mean±SD.n=10)GroupControlShencicapsuleDDP

Shencicapsule+DDP

**

AKTmRNA3.73±0.67

*##

2.20±0.31**##

2.47±0.29**

1.55±0.37*##

P<0.01vscontrolgroup;P<0.01vsShencicapsule+

DDPgroup.

7

P-gpmRNA3.15±0.39

*##

2.22±0.38**##

1.99±0.53**

1.32±0.22*##

参慈胶囊与顺铂对人肺腺癌A549/DDP肺癌组织mTORmRNA的表达的影响

各治疗组与对照组比较,人肺腺癌A549/DDP肺癌组织mTORmRNA的表达均降低,其中参慈胶mTORmRNA表达进囊+顺铂组与其它治疗组比较,一步降低,差异具有统计学意义(P<0.05),见表7。

表7

各组人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织mTORmRNA的表达

Table7.EffectsofShencicapsuleandDDPontheexpressionof

mTORmRNAinA549/DDPcellxenograft(Mean±SD.n=10)GroupControlShencicapsuleDDP

Shencicapsule+DDP

**

P<0.01vscontrolgroup;P<0.01vsShencicapsule+

DDPgroup.

5

参慈胶囊与顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞移

植瘤组织PI3KmRNA表达的影响

各治疗组与对照组比较,人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织PI3KmRNA的表达均降低,其中参PI3KmRNA的慈胶囊+顺铂组与其它治疗组比较,表达进一步降低,差异具有统计学意义(P<0.01),见

mTORmRNA3.29±0.47

*#

2.13±0.53**#

2.09±0.54**

1.45±0.20*#

表5。

6参慈胶囊与顺铂对人肺腺癌A549/DDP细胞移植瘤组织AKTmRNA表达的影响

P<0.01vscontrolgroup;P<0.05vsShencicapsule+

DDPgroup.

·504·

讨论

各治疗组与对照组比较,均能降低人肺腺癌A549/

gpmRNA的表达,DDP肺癌组织P-其中参慈胶囊+顺铂组与其它各组比较,差异具有统计学意义。推测参

慈胶囊可能通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,从

DDP是NSCLC化疗中有效且广泛应用的一线

DDP不仅通过细胞毒作用直接杀伤癌细胞,药物,还可以通过诱导细胞凋亡而发挥作用,但是由于耐药性问题的存在,严重影响其进一步疗效。PI3K是一

gp介导的顺铂耐药。而逆转P-综上所述,本研究建立人肺腺癌A549/DDP荷种可催化磷脂酰肌醇D3位磷酸化的脂类激酶。瘤裸鼠模型,通过PI3K/AKT/mTOR信号通路探讨AKT是一个丝/苏氨酸蛋白激酶,是PI3K下游的作参慈胶囊、顺铂和参慈胶囊+顺铂3种不同的给药用靶点。mTOR是一种与PI3K/AKT通路相关的蛋方式,对人肺腺癌A549/DDP荷瘤裸鼠体内顺铂耐

mTOR作为AKT的一个底物而被激活。药的影响。结果显示参慈胶囊+顺铂组较其它治疗白激酶,

PI3K/AKT/mTOR信号通路在恶性肿瘤发生、侵袭、组能够抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,增加转移及化疗耐药中具有重要的影响,其作用主要是促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进肿瘤血管生

[5-7]

。本研究采用流式细胞术分析各组人肺腺癌成

A549/DDP细胞周期与细胞凋亡。结果显示对照组

PTEN的表达,gp、PI3K、AKT和mTOR的表抑制P-达,提示中药联合化疗,较单纯中药或者单纯化疗更能在临床获益,可能在一定程度上能够减轻或者延缓多药耐药的发生。下一步可深入探讨参慈胶囊联合顺铂在不同的给药时间、不同的给药周期,对人肺腺癌A549/DDP荷瘤裸鼠体内顺铂耐药的影响。

[参

献]

亚二倍体凋亡峰不明显,各治疗组出现亚二倍体凋

亡峰,凋亡细胞的数量明显增多,与对照组比较差异有统计学意义。参慈胶囊组、顺铂组与参慈胶囊+顺铂组比较,差异具有统计学意义。细胞周期分析显示,各治疗组对肺癌细胞增殖具有抑制作用,导致

其中参慈胶囊+顺铂组与其它细胞阻滞于G2/M期,

治疗组比较,差异具有统计学意义。研究结果提示

参慈胶囊能够直接抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,从顺铂耐药具有直接的对抗作用。

PTEN是具有磷酸酶活性的抑癌基因,在多种肿PTEN通过负调控PI3K/AKT通瘤细胞中异常表达,

路从而抑制mTOR活性。PTEN的异常表达可导致PI3K/AKT通路的激活,上调mTOR表达,促进了肿瘤细胞的增殖,抑制细胞的凋亡,介导细胞的多药耐药。因此,上调PTEN的表达,或使用PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制剂,可逆转肿瘤细胞的多药耐药,提高化疗的疗效。本研究显示,各治疗组与对照组比较,人肺腺癌A549/DDP肺癌组织PTENmRNA的表达均增加,其中参慈胶囊+顺铂组与其它治疗组比较,差异具有统计学意义。由此推测,参慈胶囊通过上调PTEN的表达,从而负向调控PI3K/AKT/mTOR信号通路,逆转顺铂耐药。PI3K/AKT/mTOR信号转导通路介导的多此外,

gp介导的多药耐药存药耐药与经典多药耐药,如P-gp的表在密切的联系,抑制AKT表达能够下调P-gp介导的多药耐药[9]。本研究显示,达,从而逆转P-[8]

[1]曹品容,孔应利,罗燕梅,等.PI3K-Akt-mTOR信号通

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Akt-mTOR信号途径在丽,韩春春,刘秀云.PI3K-.生物学杂志,2014,细胞生长增殖中的调控作用[J]31(1):75-77.[3]徐立群,徐

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J].新中疗Ⅲb及Ⅳ期非小细胞肺癌的近期疗效观察[2011,43(10):72-74.医,[4]梁

昆,徐立群,薛兴阳,等.参慈胶囊影响人肺腺癌A549/DDP裸鼠体内多药耐药DNA损伤修复的研究[J].云南中医学院学报,2016,39(3):1-4.[5]费洪荣,赵

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.现代肿瘤医学,2016,14与非小细胞肺癌的关系[J](6):2323-2326.

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(责任编辑:卢

萍,罗

森)

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